Catégories
Uncategorized

Le complexe RALF1-FERONIA affecte la dynamique d’épissage pour moduler les réponses au stress et la croissance des plantes


RÉSULTATS

La liaison du peptide RALF1 au FER déclenche l’inhibition de la croissance des racines (6). Pour déterminer comment RALF1 affecte le transcriptome dans les racines, nous avons effectué le séquençage de l’ARN (RNA-seq) des racines de type sauvage (WT; Col-0) Arabidopsis plantes après 1 heure de traitement RALF1. L’analyse des composants principaux (ACP) a été réalisée pour déterminer le rôle de RALF1 dans le transcriptome (c’est-à-dire dans l’expression génique et la SA). L’effet de RALF1 sur l’ARNm AS a pu être observé dans PC1, ce qui expliquait 46,1% de toute la variance d’épissage, bien plus élevée que la variance intra-groupe (PC2) (fig. S1A). Cependant, l’effet de RALF1 sur l’expression génique était mineur (fig. S1A) et peut avoir été un effet secondaire causé par le traitement RALF1. Cette hypothèse est cohérente avec le petit nombre de gènes différentiellement exprimés ( logFC > 1; P <0,05) et le grand nombre de défauts d'épissage détectés dans les données ARN-seq des plantes traitées au RALF1 (tableau S1). Nous avons détecté 3401 événements AS significativement modifiés dans les plantes traitées avec RALF1 par rapport aux témoins simulés (P < 0.05, exon inclusion level change > 0,05, n = 3; voir Matériaux et méthodes pour plus de détails) (Fig. 1A et tableau S1). L’analyse de l’ontologie des gènes (GO) a indiqué que parmi ces événements de SA, les fonctions liées à la réparation de l’ADN et à la biosynthèse des acides aminés cellulaires étaient prédominantes, suivies des fonctions liées aux réponses au stress. [e.g., abscisic acid (ABA) and abiotic stresses] et différenciation des cellules radiculaires (fig. S1B et tableau S1). Ce résultat indique que de nombreux gènes liés au stress et les gènes de biosynthèse d’acides aminés cellulaires répondent rapidement à RALF1 par le biais d’un traitement pré-ARNm. Ensuite, nous avons sélectionné au hasard 20 événements AS avec un large éventail de changements de niveau d’inclusion selon les données RNA-seq pour une validation indépendante (voir Matériels et méthodes pour plus de détails). Seize d’entre eux se sont révélés avoir des différences significatives en utilisant la réaction en chaîne par polymérase semi-quantitative (semi-qPCR), similaires aux résultats obtenus avec les données RNA-seq (fig. S2, A à D). Les quatre autres événements de SA qui n’ont pas été confirmés avaient un P valeurs (c’est-à-dire, fiabilité relativement faible), comme indiqué par les données RNA-seq (fig. S2, A à D). Par rapport à ceux des plantes traitées simulées, 23 gènes présentaient des niveaux de transcription qui étaient au moins deux fois plus élevés dans les plantes traitées au RALF1, tandis que 220 gènes présentaient des niveaux de transcription au moins deux fois inférieurs (P <0,05) (fig. S3A et tableau S1). Les gènes différentiellement exprimés ( logFC > 1; P <0,05) chez les plantes traitées avec RALF1, des protéines codées avec diverses fonctions, telles que la transduction du signal et les réponses de défense, mais pas la voie liée à la croissance des racines (fig. S3B et tableau S1). En outre, nous avons supposé que les changements d'épissage observés étaient médiés par le spliceosome, ce qui suggère qu'une perturbation des composants de l'épissage et des facteurs d'épissage clés modifierait la réponse RALF1. Nous avons utilisé un test d'inhibition de la croissance des racines primaires médié par RALF1 comme lecture pour tester cette hypothèse (6). Nous avons observé les réponses RALF1 des mutants dans les composants principaux de l’épissosome (lsm8-1) et certains facteurs d’épissage (sr45-1 et sua-4) et a constaté que le sr45-1 et lsm8-1 mutants, mais pas les sua-4 mutant, a montré une sensibilité réduite à RALF1. le fer-4 mutant, qui est déficient en kinase de récepteur apparenté pour RALF1, était moins sensible à une concentration plus faible de RALF1 (1 μM) que les plantes WT dans les essais d’inhibition de la croissance des racines (Fig.1B et Fig.S3, C et D) comme décrit dans une œuvre antérieure (6). Notamment, fer-4 était toujours sensible à des concentrations plus élevées de RALF1 (3 à 5 μM; fig.S3, E et F), ce qui a déjà été rapporté (6). Cela suggère qu’il pourrait y avoir d’autres récepteurs RALF1 dans différentes conditions de croissance. En outre, nous avons également testé si d’autres peptides RALF sont impliqués dans la régulation de la SA. RALF23 (1 μM), mais pas 1 μM RALF17, ont induit moins d’inhibition de la croissance des racines sr45-1 et lsm8-1 par rapport à WT, suggérant que RALF23 était également impliqué dans la régulation AS (Fig. 1B et Fig. S3, C et D). Ensemble, ces données ont indiqué que l’épissage contribue à la réactivité à RALF1 et RALF23. Parce que le LSM8 a été impliqué dans la désintégration de l’ARN nucléaire, il reste possible que la dégradation de l’ARN contribue également à l’effet de RALF1 sur la croissance des racines chez lsm8-1 (12).

Fig. 1 RALF1 affecte l’épissage global de l’ARN et son récepteur FER interagit avec la protéine de liaison à l’ARN GRP7.

(UNE) Différents types d’événements AS sont modifiés de manière significative dans les racines traitées au RALF1 des plantes WT (Col-0) par rapport aux racines traitées simulées (3401 événements au total). (B) Inhibition de la croissance des racines médiée par les RALF. Différents génotypes ont été cultivés dans un milieu traité et un milieu avec 1 μM de RALF (n = 20 pour chaque groupe); chaque barre indique la moyenne ± écart-type de trois réplicats biologiques. Une ANOVA à un facteur avec le test de Tukey a été utilisée pour déterminer la différence statistique, **P <0,01. (C) Dosage de la β-galactosidase dans le système Y2H. Les contrôles négatifs (AD et BD) sont affichés. Les données sont présentées comme la moyenne ± écart-type de trois réplicats biologiques. ANOVA à un facteur avec le test de Tukey, **P <0,01. () Test déroulant de la GST. La protéine GST et les protéines His-FER-KD ont été détectées par analyse Western blot (WB). La protéine d’entrée GST a été visualisée avec du bleu brillant de Coomassie (CBB). La protéine GRP7 a été divisée en deux parties: la région N-terminale, nommée GRP71–87, contenait un domaine RRM, et la région C-terminale, nommée GRP787–176, contenait un domaine riche en GC. (E) Test BiFC dans Arabidopsis protoplastes. La membrane cellulaire a été visualisée par coloration au FM4-64. Des contrôles négatifs (GRP6-cCFP + FER-nVenus et GRP7-cCFP + CVY1-nVenus) sont également représentés. DIC, contraste d’interférence différentiel. (F) Tests Co-IP. Le FER immunoprécipité et le GRP7 co-immunoprécipité ont été reconnus à l’aide d’anticorps anti-FLAG et anti-GRP7, respectivement. Les voies d’entrée sont indiquées, la β-actine a été utilisée comme contrôle de chargement. Trois expériences indépendantes ont été menées avec des résultats similaires à ceux indiqués en (D) à (F).

Étant donné que FER agit comme un récepteur de RALF1 (6), nous avons considéré que RALF1 pourrait réguler AS via FER. Nous avons évalué plusieurs événements AS déclenchés par RALF1 dans Col-0 et le knockout FER (fer-4) mutant et a découvert que l’épissage déclenché par RALF1 change (illustré par les gènes AT4G32060, AT1G48175, AT1G54110, AT5G49230, et AT3G27340) étaient altérés dans le fer-4 mutant (fig. S3G). Ensuite, nous nous sommes concentrés sur les facteurs potentiels en aval de RALF1-FER. Dépistage de Arabidopsis Les bibliothèques d’ADN complémentaires (ADNc) avec le domaine FER-kinase (FER-KD) comme appât ont identifié une version tronquée de GRP7 (60 à 176 acides aminés). GRP7 contient un motif de reconnaissance d’ARN N-terminal (RRM) et un domaine C-terminal riche en glycine et il a été rapporté qu’il fonctionne dans le traitement de l’ARN (13, 14), floraison (15), la réponse immunitaire (16) et le système circadien (17). Nous avons d’abord confirmé que la protéine GRP7 pleine longueur interagissait avec le FER-KD dans la levure (Fig.1C et Fig.S4A) (18). Nous avons ensuite découvert que le domaine riche en glycine (87 à 176 acides aminés, extrémité C), mais pas le domaine RRM (1 à 86 acides aminés, extrémité N), de GRP7 était responsable de l’interaction (Fig. 1C et Fig. S4A). Nous avons en outre remarqué que GRP8, un paralogue de GRP7, interagissait également avec FER. En plus de FER, GRP7 interagit avec certains membres de la famille de gènes FER, tels que HERK2 (fig. S4, B et C). En accord avec les résultats de la levure à deux hybrides (Y2H), des expériences de pull-down avec des variants de GRP7 recombinants ont suggéré que GRP7-GST, GRP787–176-GST et GRP8-GST, mais pas GRP71–86-GST, a interagi avec His-FER-KD (18) in vitro (Fig. 1D et Fig. S4, D et E). Ensuite, nous avons confirmé l’interaction entre GRP7 et FER par complémentation de fluorescence bimoléculaire (BiFC) dans Arabidopsis protoplastes. Nous avons confirmé l’expression de la protéine fluorescente cyan GRP7 – C-terminal (cCFP) [or GRP6-cCFP (AT1G18630) as a negative control] et FER-nVenus (ou CVY1-nVenus comme contrôle négatif; CVY1 code pour un membre du CrFamille RLK1L similaire à FER) (fig. S4F). Les résultats ont montré que GRP7, mais pas le témoin négatif GRP6, interagissait avec FER au niveau de la membrane plasmique (indiqué par le colorant styryle FM4-64); GRP7 n’a pas interagi avec CVY1 dans le test BiFC (Fig. 1E). En outre, les tests de coimmunoprécipitation (Co-IP) utilisant Ubi: FER-FLAG les plantes transgéniques et le contrôle Col-0 / Mock ont ​​confirmé l’interaction entre FER et GRP7 in vivo (figure 1F). Collectivement, ces données indiquent que FER interagit physiquement avec GRP7.

Pour déterminer si le FER peut phosphoryler le GRP7, nous avons réalisé des tests de phosphorylation in vitro (18) avec GRP7-GST purifié, His-FER-KD et His-FERK565R-KD kinase-mort (18) protéines témoins négatives. Comme le montre la figure 2A, un anticorps contre les résidus sérine phosphorylés (anti-pSer) a reconnu la protéine GRP7 lorsque GRP7 a coïncidé avec His-FER-KD (piste 2) mais pas lorsque GRP7 a coïncidé avec le témoin négatif His-FERK565R-KD (voie 3). His-FER-KD a été détecté en raison de sa capacité d’autophosphorylation (18, 19) et la phosphatase alcaline [calf intestinal phosphatase (CIP)] His-FER-KD et GRP7 déphosphorylés (piste 4). Ensuite, nous avons utilisé un système de phosphorylation in vitro induit par l’ABA pour identifier le (s) site (s) de phosphorylation de GRP7 (19). En bref, nous avons coexprimé FER-KD (ou FERK565R-KD kinase-morte comme contrôle négatif), la résistance du récepteur ABA à la pyrabactine comme 1 (PYL1), la protéine phosphatase de type 2C insensible à l’acide abscisique 1 (ABI1) qui déphosphoryle le FER et inhibe l’activité de la kinase FER (20) et GRP7 en un Escherichia coli souche. ABA a déclenché FER-KD mais pas FERK565R-KD taux de phosphorylation mort-kinase. Six résidus phosphorylés (Tyr111, Ser112, Ser132, Tyr138, Ser139, et Ser140) de GRP7 ont été identifiés dans le système PYL1 / ABI1 / FER-KD / GRP7 incubé ABA et non dans le système PYL1 / ABI1 / FER-KD incubé ABAK565R/ Système GRP7 (fig. S5, A à F). Tyr111 et Tyr138 ont été conservés dans 13 espèces végétales (fig. S6, A et B). De plus, nous avons muté ces six sites de phosphorylation identifiés (fig. S5, A à F) en résidus alanine (GRP7mut6A) pour inactiver de manière constitutive ces sites de phosphorylation et testé si le GRP7 mutémut6A-GST a été phosphorylé par His-FER-KD in vitro. Les résultats ont montré que GRP7mut6A-GST n’a pas été phosphorylé par His-FER-KD (piste 5; figure 2A), ce qui suggère que certains résidus peuvent être phosphorylés par FER. Pour déterminer si la phosphorylation de GRP7 par FER est régulée par RALF1, nous avons obtenu GRP7-GFP lignées exprimant GRP7-GFP (protéine fluorescente verte) sous le contrôle du promoteur constitutif du virus de la mosaïque du chou-fleur 35S dans le fond WT et GRP7-GFP / fer-4 lignes (fig. S6, C à F). L’immunoprécipitation (IP) de GRP7-GFP à l’aide de billes de piège GFP a montré que les niveaux de phosphorylation de Ser et de Tyr étaient améliorés après le traitement RALF1 dans GRP7-GFP plantes (voies 1 et 2; Fig. 2B) mais étaient plus faibles, avec ou sans traitement RALF1, en GRP7-GFP / fer-4 plantes que dans GRP7-GFP plantes (voies 3 et 4; figure 2B). De plus, nous avons analysé les résidus phosphorylés de GRP7 dans GRP7-GFP plantes avec traitement simulé ou traitement RALF1 par spectrométrie de masse quantitative (MS) sans marqueur. Phosphorylation de Ser132 et Ser139 était significativement plus élevée après le traitement RALF1 qu’après un traitement simulé (Fig. 2, C et D). Nous n’avons pas détecté de phosphorylation des quatre autres résidus qui ont été identifiés dans le système PYL1 / ABI1 / FER-KD / GRP7 incubé avec ABA (fig. S5, A à F). Ce résultat peut être dû au bruit et aux limites de détection dans la SEP et / ou à certains autres mécanismes inconnus (par exemple, la phosphorylation réversible).

Fig. 2 FER phosphoryle GRP7 de manière dépendante de RALF1.

(UNE) FER phosphoryle GRP7. La figure présentée ici est représentative de trois expériences indépendantes avec des résultats similaires. (B) FER phosphoryle GRP7 en réponse à RALF1 (1 μM, 30 min). Le rapport anti-pSer / anti-GFP ou anti-pTyr / anti-GFP est affiché sous les transferts. Les données présentées sont représentatives de trois expériences indépendantes. «Contrôle» fait référence aux usines WT (Col-0). (C) Exemples de phosphopeptides de GRP7. La probabilité maximale indiquée pour chaque site de phosphorylation a été calculée par Proteome Discoverer. () Les abondances relatives de deux phosphopeptides détectés dans GRP7-GFP purifié à partir de plants traités et non traités avec RALF1. L’intensité du phosphopeptide indiqué contenant le site de phosphorylation respectif a été déterminée par l’aire de pic MS1 sans marqueur de chaque phosphopeptide telle qu’estimée par MaxQuant. Les données représentent trois répliques biologiques. L’intensité de quantification sans marqueur (LFQ) du phosphopeptide dérivé de MaxQuant a été normalisée par rapport à l’intensité LFQ du GRP7-GFP entrée puis convertie en abondance relative en divisant par la moyenne (n = 3) du phosphopeptide le plus abondant (S132) détecté, qui a été fixé à 100%. Les données sont présentées comme les moyennes ± écart type, élève t tester. **P <0,01. ATP, adénosine triphosphate.

Pour tester si GRP7 est responsable des changements AS observés lors du traitement RALF1 (Fig. 1A), nous avons effectué RNA-seq. Pour cela, nous avons utilisé un grp7-1 Mutant T-ADN qui porte en outre une construction d’interférence ARN (ARNi) contre GRP8, désigné grp7-1 8i (15). GRP7 régule négativement son paralog GRP8 (14), et la construction ARNi sert à contrecarrer la régulation à la hausse de GRP8 qui se produit dans le grp7-1 mutant en raison du soulagement de la répression (14). Considérant que GRP7 est une protéine régulée par l’horloge circadienne (17), nous avons réalisé RNA-seq pour Col-0, fer-4, et grp7-1 8i racines des semis après 12 heures de lumière, lorsque GRP7 montre la plus haute expression d’ARNm (17). Nous avons identifié 3509 événements AS significatifs dans le fer-4 mutant par rapport au contrôle WT (P < 0.05, exon inclusion level change > 0,05, n = 3) (Fig. 3A et tableau S1). De plus, nous avons détecté 3822 événements AS (P < 0.05, inclusion level change > 0,05, n = 3) dans le grp7-1 8i mutant par rapport au contrôle WT (Fig. 3A et tableau S1). Notamment, tous les événements AS décrits dans notre travail représentent l’abondance relative des événements AS dans chaque groupe par rapport à sa simulation WT. Il y avait un chevauchement significatif entre les événements détectés dans les deux comparaisons (P = 3,2 × 10−342, test hypergéométrique) (Fig. 3A). Il est possible que FER régule la SA également via d’autres protéines de liaison à l’ARN, par exemple, GRP8 et notre grp7-1 8i mutant est le seul mutant de GRP7 avec une expression GRP8 normale (15). Ainsi, le chevauchement en AS entre les fer-4 et grp7-1 8i mutants était d’environ 30%. La plupart des changements d’épissage étaient dans la même direction et les valeurs étaient très cohérentes (r = 0,936, P <0,0001) (Fig. 3B et tableau S1). En outre, l'analyse de regroupement a indiqué que la plupart des changements d'épissage dans fer-4 et grp7-1 8i étaient corrélés, changeant dans le même sens (Fig. 3C). Les gènes avec des défauts d’épissage dans les deux fer-4 et grp7-1 8i les plantes comparées aux plantes WT codaient pour des protéines associées à des processus biologiques distincts, y compris les réponses au stress et le développement (par exemple, signalisation ABA et développement des racines) (fig. S7, A et B). À partir des données RNA-seq, nous avons choisi 12 événements AS détectés dans les deux fer-4 et grp7-1 8i les plantes. Nous avons validé avec succès 11 des 12 événements AS sélectionnés en utilisant semi-qPCR (fig. S7, C à E). En parallèle, nous avons réalisé RNA-seq sur Col-0, fer-4, grp7-1 8iet les plantes Col-0 traitées au RALF1. L’épissage change dans FER ou GRP7 Les mutants knock-out par rapport aux plantes Col-0 traitées par RALF1 étaient fortement corrélés (fig. S8, A et B, et tableau S1), et les changements d’épissage dans les cibles communes (P <0,05 pour les deux déclenchés par RALF1 et fer-4 ou grp7-1 8i) étaient également très cohérents (r = 0,797, P = 3,54 × 10−161 pour RALF1 versus fer-4 et r = 0,816, P = 1,51 × 10−176 pour RALF1 versus grp7-1 8i) (fig. S8, C et D, et tableau S1), suggérant que les changements d’épissage déclenchés par RALF1 étaient partiellement médiés par FER et GRP7.

Fig. 3 GRP7 fonctionne en aval de RALF1-FER pour réguler l’AS et la condition physique des plantes.

(UNE) Diagramme de Venn illustrant le chevauchement des changements d’épissage significatifs (P < 0.05, exon inclusion level difference > 0,05, n = 3) entre fer-4 et grp7-1 8i (par rapport à Col-0). P = 3,2 × 10−342; le test hypergéométrique a été utilisé dans l’analyse de chevauchement. (B) Figure de densité montrant la comparaison entre les changements d’épissage FER knockout et GRP7 Assommer (n = 3). le X et y les axes représentent les changements du niveau d’inclusion; la zone rouge indique une densité élevée. La corrélation de Spearman a été utilisée pour l’analyse de corrélation. (C) Carte thermique des changements d’événements AS différentiels fer-4 (n = 3) et grp7-1 8i (n = 3) par rapport à WT (Col-0). Sig. indique P < 0.05 for either mutant and splicing difference > 0,05. () Données statistiques de longueur de racine avec ou sans traitement RALF1 (n = 20 racines par condition). Différentes lignes sont indiquées par «-nombre». Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écart type. (E) Diagramme à barres des ratios d’inhibition des ROS de différents génotypes sans ou avec 1 μM de traitement RALF1 (n = 2). Le nombre total de photons après le déclenchement de flg22 a été défini comme I, le nombre total de photons après RALF1 et le déclenchement de flg22 a été défini comme J, le rapport d’inhibition ROS = (IJ) / I × 100% et le nombre total de photons détaillé est indiqué dans figure. S8E. La barre indique les moyennes ± écart-type de deux expériences indépendantes. (F) Longueurs de racines de différents génotypes traités avec 0 ou 5 mM ABA. La photographie a été prise 4 jours après le transfert des plants. Barres d’échelle, 1 cm. (g) Analyse statistique de la longueur des racines en réponse à ABA. Les longueurs de 324 racines (n = 18 racines par groupe) ont été mesurées. Les données sont représentées par les moyennes ± SD. Toutes les évaluations ont été répétées indépendamment quatre fois avec des résultats similaires. ANOVA à un facteur avec le test de Tukey, *P <0,05, **P <0,01. n.s., non significatif.

Pour élucider si GRP7 est impliqué dans la transduction du signal RALF1-FER, nous avons testé l’inhibition de la croissance des racines primaires par RALF1 (6). le fer-4 et grp7-1 8i les mutants étaient moins sensibles à RALF1 que les plantes WT, tandis que GRP7-GFP, qui surexprimait GRP7, était plus sensible (Fig. 3D). De plus, la surexpression de GRP7 dans le grp7-1 8i mutant complétait son phénotype tolérant RALF1, indiquant que la perte de fonction de GRP7 était responsable de ce phénotype (Fig. 3D). De plus, pour déterminer si les sites de phosphorylation de GRP7 étaient impliqués dans la réponse RALF1, nous avons muté les six sites de phosphorylation de GRP7 en Ala (GRP7mut6A) ou Asp (GRP7mut6D) pour imiter la phosphorylation de GRP7 perturbée ou constitutive, respectivement. GRP7mut6D-GFP / grp7-1 8i les plantes étaient plus sensibles à RALF1, tandis que GRP7mut6A-GFP / grp7-1 8i les plantes étaient moins sensibles à RALF1 que GRP7-GFP / grp7-1 8i plante (Fig. 3D et Fig. S6E), indiquant que la phosphorylation médiée par FER de GRP7 est importante pour la réponse RALF1 médiée par GRP7. Ces résultats suggèrent que GRP7 pourrait être impliqué dans la voie RALF1-FER.

Production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) déclenchée par la flagelline bactérienne22 (flg22) (21) et RALF1 ainsi que les peptides RALF apparentés conduisent à l’inhibition de la production de ROS induite par flg22 (7, 19), ainsi l’inhibition de la production de ROS induite par le flg22 médiée par RALF1 est une caractéristique des réponses RALF1. Nous avons surveillé la production de ROS déclenchée par flg22 et avons constaté que fer-4 et grp7-1 8i les usines avaient des rafales de ROS plus faibles que Col-0, tandis que GRP7-GFP les lignes de surexpression avaient des sursauts ROS plus forts (fig. S8E). Ces données sont cohérentes avec les études précédentes, montrant que FER et GRP7 jouent un rôle dans les réponses immunitaires (7, 16). Lorsqu’il est traité avec FLG22 et RALF1 combinés, fer-4 et grp7-1 8i étaient moins sensibles que le WT au traitement RALF1, comme en témoigne une inhibition réduite des sursauts ROS (52,5% pour Col-0, 19,1% pour fer-4et 24,9% pour grp7-1 8i) (Fig. 3E et Fig. S8E). En revanche, GRP7-GFP # 2 les mutants étaient plus sensibles à RALF1 que les plantes WT (taux d’inhibition de 66,9%) (Fig. 3E et Fig. S8E). Lorsqu’elle est exprimée en grp7-1 8i, GRP7-GFP peut compléter la production de ROS altérée de grp7-1 8i (Fig. 3E et Fig. S8E), indiquant que la perte de GRP7 était bien la cause de ce phénotype. Ensemble, ces résultats ont en outre indiqué que FER et GRP7 sont impliqués dans les réponses RALF1.

En plus de l’immunité des plantes, la voie RALF1-FER régule les réponses ABA, modulant ainsi les réponses aux stress abiotiques (dix). En l’absence d’ABA, les racines primaires des différents génotypes analysés étaient presque identiques (Fig. 3, F et G). Cependant, en présence de 5 μM ABA, le grp7-1 8i et fer-4 les mutants ont montré une inhibition de la croissance des racines plus forte que le WT (Fig. 3, F et G). Les phénotypes sensibles à l’ABA de grp7-1 8i en ce qui concerne la croissance des racines ont été sauvés par la surexpression de GRP7. En comparant les mutations des sites de phosphorylation de GRP7, nous avons constaté que GRP7mut6A-GFP / grp7-1 8i a montré une hypersensibilité à l’ABA, tandis que GRP7mut6D-GFP / grp7-1 8i a montré une tolérance ABA plus élevée que GRP7-GFP / grp7-1 8i plantes (Fig.3, F et G). Nous avons ensuite évalué les réponses de verdissement des cotylédons de ces différents génotypes avec ou sans ABA et avons abouti à des conclusions similaires à celles de l’inhibition primaire de la croissance des racines induite par l’ABA (fig. S8, F et G). Ces résultats indiquent que GRP7, avec FER, joue un rôle négatif dans les réponses ABA et que la phosphorylation de GRP7 est cruciale pour son rôle dans ce processus.

Nous nous sommes ensuite demandé comment la voie RALF1-FER affecte mécaniquement l’épissage de l’ARN via la phosphorylation médiée par FER de GRP7. Étant donné que l’épissage pré-ARNm se produit dans le noyau et que GRP7 est une protéine de navette nucléocytoplasmique (22), nous avons testé l’impact de RALF1 sur la localisation subcellulaire de GRP7. Nous avons traité GRP7 :: GRP7-GFP semis (grp7-1 plantes exprimant GRP7-GFP sous le contrôle de son promoteur natif, mimant ainsi le niveau d’expression endogène) (23) avec RALF1. La microscopie confocale a révélé que la GFP était présente dans les noyaux de plus de cellules après le traitement RALF1 que le traitement simulé (Fig. 4, A et B). De même, des tests d’immunofluorescence ont montré que RALF1 a déclenché l’accumulation de GRP7 dans le noyau, et moins de cellules ont montré une localisation nucléaire de la protéine GRP7 dans le fer-4 fond que dans le fond WT après traitement RALF1 (fig. S9, A et B). Des analyses de fractionnement nucléaire et cytoplasmique ont montré que le GRP7 s’accumulait dans le noyau des usines WT après le traitement RALF1, mais ce processus a été entravé dans fer-4 mutants (fig. S9C). Avec ou sans traitement RALF1, moins de cellules présentaient de la GFP dans le noyau du GRP7-GFP / fer-4 et GRP7mut6A-GFP lignes que dans le GRP7-GFP ligne (fig. S9, D et E). En outre, plus de cellules ont montré de la GFP dans le noyau dans le GRP7mut6D-GFP / grp7-1 8i par rapport à GRP7-GFP / grp7-1 8i (fig. S9, F et G). Sur la base de ces observations, nous suggérons que l’accumulation nucléaire de GRP7 est favorisée par la voie RALF1-FER et que cette promotion est partiellement dépendante de la phosphorylation médiée par FER.

Fig. 4 RALF1-FER régule l’épissage de l’ARN via la phosphorylation médiée par FER de GRP7.

(UNE) Images représentatives de GRP7 :: GRP7-GFP racines dans des semis de 5 jours avec ou sans RALF1. (B) La couche choisie [yellow lines inside (A) show the areas used for line scan measurements] a été analysé pour l’intensité en utilisant ImageJ, et les profils de parcelle résultants sont affichés. (C) Analyse Y2H de l’interaction entre GRP7 et U1-70K ou U2AF35A. () Test BiFC dans Arabidopsis protoplastes. L’interaction entre GRP7 et U1-70K, qui a produit la GFP, s’est produite dans le noyau. (E) Diagramme à barres du nombre de protoplastes avec GFP nucléaire en (D) avec ou sans peptide RALF1[1μM3heures;[1μM3heures;[1μM3hours;[1μM3hours;n (nombre de protoplastes)> 114 dans chaque expérience]. Les valeurs représentent les moyennes ± écart-type de trois répliques. Étudiants t test, **P <0,01. (F) Capacité de GRP7 à se lier ABF1 sondes ARN sens. Les quantités de 1 × GRP7 et 1 × pGRP7 étaient les mêmes. (g) Tests RIP. ABF1, PUB9, et LRK10L1.1 des fragments de pré-ARNm contenant des sites de liaison putatifs de GRP7 sont indiqués sur la fig. S8A. Les niveaux dans le précipité du piège à GFP sont présentés par rapport aux niveaux dans l’entrée. Les valeurs sont des moyennes ± SD (n = 3 répliques techniques). ANOVA avec le test de Tukey; **P <0,01. (H) Analyse semi-qPCR de transcriptions GRP7 dans différents milieux. Toutes les évaluations ont été répétées indépendamment quatre fois avec des résultats similaires.

Pour commencer à comprendre comment GRP7 influence l’activité du spliceosome, nous avons testé si GRP7 interagissait avec les petites ribonucléoprotéines nucléaires U1 et U2 (snRNP), qui jouent un rôle dans la définition des sites d’épissage 5 ‘et 3’, respectivement (24). Nous avons d’abord évalué l’interaction de GRP7 avec U1-70K ou U2AF35A en utilisant Y2H et a constaté que GRP7 interagissait avec U1-70K mais pas U2AF35A (Fig. 4C). Nous avons ensuite utilisé BiFC pour confirmer que GRP7-cCFP interagissait avec U1-70K-nVenus dans le noyau, mais pas avec le contrôle négatif du facteur de transcription de type GATA ZML1 (Fig. 4D). Le pourcentage de cellules qui ont montré un signal de fluorescence GFP dans le noyau a augmenté lorsque RALF1 a été ajouté à Arabidopsis protoplastes (Fig. 4E), indiquant que le traitement RALF1 a augmenté l’interaction entre GRP7-cCFP et U1-70K-nVenus dans le noyau.

Dans des travaux antérieurs, 452 cibles de liaison au GRP7 ont été identifiées à la fois par réticulation par résolution de nucléotides individuels et séquençage IP (iCLIP) et ARN IP (RIP) (23). Nous avons effectué une analyse GO et avons remarqué que ces cibles étaient impliquées dans la photosynthèse, la réponse au froid et la réponse ABA (fig. S10A). En prenant comme exemples les gènes liés à l’ABA, nous avons analysé les séquences d’ADN génomique de gènes liés à l’ABA avec un épissage défectueux dans grp7-1 8i et a constaté que plusieurs d’entre eux, y compris ABF1 (25), PUB9 (26), et LRK10L1.1 (27), contenait l’un des motifs consensus de liaison à l’ARN GRP7 (UU / GCUGG) (22) (fig. S10B). Un test de déplacement de mobilité électrophorétique ARN (EMSA) a été utilisé et a confirmé que GRP7-GST, mais pas la protéine de contrôle GST, liait le PUB9, ABF1, et LRK10L1.1 ARNm (fig. S10, C à E). Nous avons également testé si la phosphorylation médiée par FER affectait l’activité de liaison à l’ARN de GRP7. Nous avons utilisé un système d’incubation ABA pour contrôler la phosphorylation in vitro du GRP7-GST par FER-KD (19) et a constaté que la capacité de liaison à l’ARN du GRP7 phosphorylé (pGRP7-GST) était supérieure à celle du GRP7 non phosphorylé (GRP7-GST) envers ABF1 ARNm (figure 4F). Comme RALF1 a amélioré le niveau de phosphorylation de GRP7, nous avons émis l’hypothèse que le module RALF1-FER peut améliorer la capacité de liaison à l’ARN de GRP7 in vivo. Ainsi, nous avons comparé la capacité de liaison à l’ARN de GRP7-GFP dans le fond WT (GRP7-GFP) et le FER fond de knockout (GRP7-GFP / fer-4). Les dosages RIP ont montré que GRP7 se liait au ABF1, PUB9, et LRK10L1.1 ARNm (Fig.4G), alors que le contrôle négatif BAK1 la transcription n’a pas été enrichie dans nos tests RIP (16). Ensuite, nous avons testé si RALF1 affecte la capacité de liaison de l’ARNm de GRP7. Les résultats ont montré que RALF1 améliorait la capacité de GRP7 à se lier ABF1, PUB9, et LRK10L1.1 dans le fond WT mais pas dans le fer-4 arrière-plan (Fig. 4G), démontrant en outre que FER médie la régulation déclenchée par RALF1 de la capacité de liaison à l’ARN de GRP7. Ces données suggèrent que RALF1 améliore la phosphorylation médiée par FER de GRP7 pour moduler la capacité de GRP7 à se lier à ses ARNm cibles.

Nous avons en outre étudié les conséquences fonctionnelles des changements d’épissage pilotés par le module RALF1-FER-GRP7. Étant donné que les facteurs de liaison des éléments de réponse ABA (ABF) jouent un rôle crucial dans la signalisation ABA (28), nous avons décidé de caractériser l’AS du facteur de transcription général ABA ABF1 en détail. ABF1 est un facteur de transcription bZIP (motif de fermeture à glissière de la région basique / leucine) pour lequel nos données ARN-seq ont détecté deux isoformes d’ARNm. La transcription intégrale ABF1.1 codé une protéine avec 392 acides aminés (29), tandis que la variante tronquée ABF1.2 codait une protéine avec 403 acides aminés en raison d’un décalage de cadre (fig. S11A). Selon nos résultats RNA-seq et semi-qPCR, dans le fer-4 et grp7-1 8i mutants, ABF1.1 affichait des niveaux d’expression accrus, tandis que ABF1.2 présentait une expression réduite (fig. S11B); ce phénomène peut avoir contribué aux défauts de réponse ABA du fer-4 et grp7-1 8i mutants. Pour le confirmer, nous avons surexprimé ABF1.1 et ABF1.2 dans WT et a constaté que les plantes surexprimaient ABF1.2 résistaient à l’ABA dans les tests de germination des graines, tandis que les plantes surexprimaient ABF1.1 étaient sensibles par rapport à WT (fig. S11, C et D). ABF1.2 la surexpression a partiellement sauvé les défauts de réponse ABA de grp7-1 8i (fig. S11, E à H). Annulation d’un seul événement d’épissage (par exemple, amélioration de ABF1.2 expression) après l’épuisement de GRP7, la viabilité des plantes n’a été que modestement sauvée. Ce résultat n’était pas inattendu, étant donné que de multiples événements d’épissage sont affectés lors de la perturbation de la voie RALF1-FER. Ces données suggèrent que le module RALF1-FER-GRP7 régule des gènes cibles spécifiques (par exemple, ABF1) pour moduler des activités cellulaires spécifiques et affecte ainsi les réponses ABA et les réponses immunitaires chez les plantes.

L’épissage et la traduction improductifs régulés (RUST) est un mécanisme qui relie l’AS à la désintégration de l’ARNm médiée par le non-sens (NMD) pour réguler l’abondance des protéines en affinant la génération d’isoformes improductives qui sont encore dégradées par la voie NMD (30). Nous avons remarqué que GRP7 pouvait être régulé via RUST. Une variante alternativement épissée (as_GRP7) la conservation d’une partie de l’intron avec un codon de terminaison prématurée peut être dégradée via NMD, ce qui réduit le niveau d’ARN GRP7 et affecte finalement l’abondance des protéines (23, 31). Nous avons constaté que le niveau de as_GRP7 dans GRP7mut6D-GFP et GRP7-GFP était plus élevé que celui de WT, alors que son niveau était inférieur GRP7mut6A-GFP (Fig.4H), indiquant que l’augmentation de l’activité GRP7 (c’est-à-dire la phosphorylation et / ou la surexpression de GRP7) déclenchera la production de as_GRP7 et suggérant que as_GRP7 la régulation à la hausse peut agir comme un mécanisme de rétroaction négative. Nous avons pris les rôles FER-GRP7 confirmés dans la réponse ABA comme un test pour vérifier cette hypothèse, car la voie FER-GRP7 inhibe les réponses ABA. Nous avons constaté que le niveau de protéine GRP7 était fortement réduit lors du traitement ABA (fig. S12A). Ajout de l’inhibiteur du protéasome MG132 (N-carbobenzyloxy-l-leucyle-l-leucyle-l-leucinal) n’a pas bloqué ce processus, indiquant que la réduction de la protéine GRP7 peut ne pas s’être produite via la voie d’ubiquitination (fig. S12A). Nous avons ensuite évalué si l’ABA régule les niveaux de protéine GRP7 en régulant les niveaux d’ARN. Cependant, le niveau total de GRP7 a augmenté après le traitement ABA (fig. S12B). En ce qui concerne la SA, nous avons constaté que les niveaux de as_GRP7, qui héberge un codon stop prématuré, augmenté après traitement ABA (fig. S12C), tandis que ceux de GRP7 ARN (fs_GRP7) a diminué de manière significative (fig. S12C). Nous avons en outre confirmé ce résultat par des mutants défectueux dans les réponses ABA et constaté que le as_GRP7 les taux ont été augmentés chez trois mutants hypersensibles ABA[[[[abi1-2 / abi2-2 / hab1-1 (20), hab1-1 / abi1-2 / pp2ca (20), et fer-4], tandis que as_GRP7 les niveaux ont été diminués dans un mutant à réponse ABA réduite[ABAreceptorhextuple[ABAreceptorhextuple[ABAreceptorhextuple[ABAreceptorhextuple112458 (20)](fig. S12D). Ces données indiquent que la signalisation ABA peut conduire à la régulation médiée par NMD de GRP7. En résumé, ces données sont cohérentes avec l’hypothèse que la régulation de GRP7 via RUST peut affiner la puissance de signalisation de la voie FER-GRP7.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Préparation d’échantillons RNA-seq

WT (Col-0), fer-4, et grp7-1 8i les semis ont été cultivés sur un milieu ½ MS pendant 7 jours dans des conditions de longue journée (16 heures de lumière / 8 heures d’obscurité). Pour éviter un effet de manipulation des plants lors du transfert du milieu solide au liquide ½ MS pour le traitement RALF1, nous avons d’abord retiré les plants du milieu solide ½ MS. Ensuite, nous avons transféré les racines des plantules dans un milieu liquide ½ MS et les avons préincubées pendant 1 heure avant le traitement. Puis, Col-0, fer-4, et grp7-1 8i les semis ont été trempés avec 1 uM de RALF1 (inclus dans le milieu liquide ½ MS) ou avec un contrôle simulé (milieu ½ MS contenant un tampon d’élution de protéines utilisé pour la purification de RALF1) pendant 1 heure. Les échantillons de racines ont été collectés à ZT (temps zeitgeber) 12 pour l’extraction d’ARN. L’ARN total a été extrait avec un kit d’isolement de microARN mirVana (Ambion, AM1561) en suivant le protocole du fabricant. L’intégrité de l’ARN a été évaluée en utilisant le bioanalyseur Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Pour tous les échantillons, le nombre d’intégrité de l’ARN était ≥9, indiquant une excellente qualité d’ARN. The cDNA libraries were constructed by using the TruSeq Stranded mRNA LT Sample Prep Kit (Illumina, San Diego, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions. The library was prepared for Illumina sequencing by Shanghai OE Biotech. Co. Ltd. and was sequenced on the Illumina sequencing platform (Illumina HiSeq X Ten).

Bioinformatics analysis

Read quality was evaluated, and low-quality reads were removed using Trimmomatic v0.36 (http://usadellab.org/cms/?page=trimmomatic) (35) with the parameters “CROP:150 ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10:8:true LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:50”. High-quality reads were mapped to the Arabidopsis TAIR10 genome using HISAT2 v2.1.1 (https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml) (36) with the parameter “-rna-strandness rf-fr”. Sam files were converted to sorted bam files using SAMtools v1.4 (37). The FPKM value of each gene was calculated using cufflinks (38), and the read counts of each gene were obtained by htseq-count (39). Differentially expressed genes were identified using the DESeq (40) R package functions estimateSizeFactors and nbinomTest. UNE P value of <0.05 and a fold change of >2 or <0.5 were set as the threshold for significant differential expression. Uniquely mapped reads were used for the identification of differential AS events using rMATS v4.0.1 (http://rnaseq-mats.sourceforge.net/) (41) with parameters “-t paired –len 150 –c 0.0001 –analysis U –libType fr-firststrand –novelSS 1.” Events with P < 0.05 and exon inclusion level change of >0.05, calculated on the basis of junction reads by rMATs, were identified as significant differential AS events. Inclusion level (ψ) was a quantitative measurement of AS (41). With exon skipping as an example, inclusion level is estimated by the proportion of exon-exon junction counts supporting the exon-inclusion isoform. Inclusion level can be applied to all AS categories (exon skipping, intron retention, alternative 5′/3′ splice site, mutually exclusive exons), with minor changes made when defining “inclusion.” The GO enrichment analysis was conducted using DAVID (42) v6.8 (https://david.ncifcrf.gov/). PCA was carried out on the basis of 1000 gene expression levels or inclusion levels (splicing) with the largest variance across the six samples (three mock controls and three RALF treatment samples) using the prcomp function in R (version 3.5.1). The RNA-seq results of splicing changes are summarized in table S1.

RNA extraction

Samples under different treatments, as indicated, were powdered in liquid nitrogen for the RNA extraction. Total RNA was extracted by TRIzol reagent (Ambion, 15596-026) and digested by deoxyribonuclease I (DNase I; Takara) to remove genomic DNA. First-strand cDNA was synthesized by using a cDNA synthesis kit (Fermentas, K1622), according to the manufacturer’s instructions.

Gene expression analyses

qPCR was performed using the CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad) with SYBR Premix ExTaqII (Takara). Semi-qPCR mixes were prepared using 2× Master Mix (TsingKe, TSE004) according to the manufacturer’s instructions with a final primer concentration of 200 nM. Reactions were performed using a PCR System (C1000, Bio-Rad) with initial incubation at 95°C for 10 min, followed by 26 cycles of 15 s at 95°C, 30 s at 55°C, and 1 min/kb at 72°C. ACTIN2 was used as a reference in qPCR analysis. PP2A was used as an internal reference in semi-qPCR analysis (43). Data are shown as the mean expression ± SD. When indicated, the fold change is shown for the treated sample in comparison to the control sample.

The following genes with significant AS changes in the RNA-seq data were chosen for independent validation by semi-qPCR. We used ImageJ to detect the ratio of two splice isoform bands. We obtained three results from three independent repeats and used one-way analysis of variance (ANOVA) to calculate statistical significance.

AT1G13450 is a homeodomain-like superfamily protein, which is assumed to act as a molecular switch modulated through Ca2+-dependent phosphorylation/dephosphorylation in response to light signals. AT1G78070 encodes a transducin/WD40 repeat-like superfamily protein. AT5G49230 is a drought-responsive family protein. AT1G28560 is a small nuclear RNA-activating complex family protein that encodes a protein similar to human SNAP50. AT3G27340 encodes a Myb domain protein. AT2G25000 encodes the WRKY60 transcription factor. AT1G13460 encodes the protein phosphatase 2A regulatory B subunit family protein. AT5G42030 encodes an ABL interactor-like protein 4. AT1G19025 encodes a DNA repair metallo-beta-lactamase family protein. AT3G12640 is an RNA binding (RRM/RBD/RNP motif) family protein. AT1G69400 encodes a transducin/WD40 repeat-like superfamily protein. AT1G79790 is a haloacid dehalogenase-like hydrolase superfamily protein that encodes a chloroplast-localized flavin mononucleotide (FMN) hydrolase. AT3G44740 is a class II aaRS and biotin synthetase superfamily protein. AT3G59810 encodes a snRNP family protein. AT1G29030 encodes an apoptosis inhibitory protein. AT1G44180 is a peptidase M20/M25/M40 family protein. AT1G54110 encodes a membrane fusion protein. AT1G76040 encodes the calcium-dependent protein kinase 29. AT5G15460 encodes a membrane-anchored ubiquitin-fold protein. AT1G48175 encodes a cytidine/deoxycytidylate deaminase family protein. AT1G13460 encodes a protein phosphatase 2A regulatory B subunit family protein. AT4G32060 encodes a calcium-binding EF hand family protein.

Because GRP7 and GRP8 have highly similar cDNA sequences, we used GRP7 primers that could distinguish GRP7 from GRP8 as previously described (13). The primers used for qPCR and semi-qPCR are listed in table S1.

Seeds and plant growth conditions

Arabidopsis thaliana ecotype Col-0 was used as the WT for all experiments. grp7-1 8i et GRP7::GRP7-GFP, fer-4, et Ubi:FER-FLAG were described in our previous works (15, 18, 23). sua-4 (44), sr45-1 (45), and lsm8-1 (12) were provided by Y. Zhang (University of British Columbia), P. Duque (Instituto Gulbenkian de Ciência), and J. Kufel (University of Warsaw), respectively. The pCAMBIA2300 plasmid carrying GRP7-GFP, GRP7mut6A-GFP, ou GRP7mut6D-GFP and the pCAMBIA1300 plasmid carrying ABF1.1-OE ou ABF1.2-OE were transformed into Agrobacterium tumefaciens strain Ag10 before transformation of the Arabidopsis ecotype Col-0. Expression of the transgenes was confirmed via qPCR. We also detected the GRP7 protein levels in these transgenic plants using the anti-GRP7 antibody (fig. S6, C and D). le GRP7-GFP/grp7-1 8i-3, -4, GRP7mut6A-GFP/grp7-1 8i-1, -5, GRP7mut6D-GFP/grp7-1 8i-3, -4, ABF1.1-OE/grp7-1 8i-1, -3, et ABF1.2-OE/grp7-1 8i-5, -6 lines were obtained by transformation of plasmids into the grp7-1 8i plants (fig. S6E). Transgenic plants were selected on kanamycin (40 μg/ml) (pCAMBIA2300)/hygromycin (pCAMBIA1300). GRP7-GFP-2/fer-4 lines were obtained by crossing GRP7-GFP-2 avec le fer-4 mutant (fig. S6F). Pour Arabidopsis growth, seeds were surface-sterilized with 75% ethanol for 3 min, washed three times with sterile water, sterilized with 15% bleach for 3 min, washed three times with sterile water, and then grown on ½ MS medium containing 0.8% (w/v) sucrose and 0.8% (w/v) agar (Sigma-Aldrich). The plates were stratified in darkness for 2 days at 4°C and then transferred to a chamber set at a light intensity of 80 μmol m−2 s−1 and a constant temperature of 22°C under 16-hour light/8-hour dark for 6 days. Then, the seedlings were potted in soil and placed in a growth room.

RALF1 and ABA response assays

For RALF1 root growth inhibition assays, 4-day-old seedlings with comparable growth vigor were transferred to liquid ½ MS medium containing 1 μM RALF1 for 2 days and then analyzed as previously described (18). For the ABA germination assay, plants of different genotypes were grown side by side, and seeds were harvested at the same time. After harvest, the fresh seeds (~40) of each genotype were surface-sterilized and sown on ½ MS plates supplemented with different ABA concentrations, as indicated in the figure. Seedlings with expanded green cotyledons were considered germinated and were used for statistical analysis at the indicated time points. For root elongation assays, seeds were stratified for 2 days in the dark at 4°C, sown, and grown on vertically oriented ½ MS plates for 4 days. Seedlings with similar primary root lengths were transferred to new ½ MS plates supplemented with the indicated concentrations of ABA. The plates were scanned on the fourth day after transfer, and primary root length was measured using ImageJ (https://imagej.en.softonic.com/).

Y2H assays

The kinase domain coding region of FER (469 to 896 amino acids, FER-KD) and the kinase domains of its relatives (At5g24010, CVY1, At4g39110, At5g39020, At5g38990, HERK2, and THE1) were cloned into the pGBKT7 (BD) vector (18), and FER-KD-BD was applied as bait in a Y2H screen of the Arabidopsis cDNA library for positive protein-protein interactions (20). Briefly, the FER kinase domain cloned into the pGBKT7 vector and the Arabidopsis cDNA library cloned into the prey vector pGADT7 were transformed into AH109 yeast cells containing FER-KD-BD. Then, the transformed cells were plated on synthetic dropout selection medium that lacked Trp, Leu, and His supplemented with 20 mM 3-AT to inhibit self-activation. For further confirmation of the interaction between GRP7/GRP8 and FER-KD, the full-length, N-terminal RRM, a C-terminal region comprising the glycine-rich region of the GRP7 coding sequence, or the full-length coding sequence of GRP8 was cloned into the pGADT7 (AD) vector and cotransformed with FER-KD into yeast strain AH109 to test their interaction. To analyze the interaction between GRP7 and U1-70K or U2AF35A, the full-length GRP7 coding sequence was subcloned into the pGBKT7 vector, and the full-length U1-70K (AT3G50670) ou U2AF35A (AT1G27650) coding sequence was cloned into pGADT7and cotransformed into AH109 to test for an interaction (20). The primers used for cloning are listed in table S1.

BiFC and confocal microscopy

The vectors for BiFC were pSAT1-cCFP (pE3449) and pSAT1-nVenus (pE3308) (18). When cCFP and nVenus are brought together via the proteins that are fused to them, GFP fluorescence will be detected (18, 20). The coding regions of GRP6 et GRP7 were cloned into pSAT1-cCFP to generate GRP6-cCFP and GRP7-cCFP, while the coding regions of FER et CVY1 were cloned into pSAT1-nVenus to generate FER-nVenus and CVY1-nVenus. The full-length coding sequence of U1-70K was cloned into pSAT1-nVenus. The primers used for the PCR are listed in table S1. The constructs were cotransfected into Arabidopsis protoplasts using polyethylene glycol according to our previous work (20). Briefly, mesophyll protoplasts were isolated from 4-week-old seedlings and transformed with 2 μg of purified plasmid DNA per construction. The transformed protoplasts were incubated in the dark at 22°C for 14 hours. After incubation, the transformed protoplasts were divided into two parts for RALF1 peptide treatments. For RALF1 treatment, 1 μM RALF1 (or the elution buffer used for RALF1 purification as mock) was added to the protoplasts and incubated for 3 hours before microscopic analysis. Fluorescence signals were detected by using a Nikon confocal laser scanning microscope with a 20× objective lens. The following wavelengths were used for fluorescence detection: excitation at 488 nm and emission at 490 to 530 nm for GFP, excitation at 543 nm and emission at 560 to 620 nm for FM4-64 and red fluorescent protein, and excitation at 350 nm and emission at 430 to 480 nm for 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). At least three independent experiments were performed for all confocal imaging data.

Protein purification and GRP7 antibody preparation

The RALF1 protein was purified as described in the manual of His Purification System (Invitrogen, R901-15) as described previously (18). The GST-tagged GRP7 were purified as described according to the manual of Pierce Glutathione Agarose (Thermo Fisher Scientific, 16100). For GRP7 antibody production, purified GRP7-GST protein was used as the antigen, and a 30-day ICR (Institute of Cancer Research) mouse (Shanghai Laboratory Animal Center laboratory animal) was injected with 50 μg of GRP7-GST protein emulsified with Complete Freund’s adjuvant (Sigma-Aldrich, F5881). The injection was repeated after 2 and 3 weeks with Incomplete Freund’s adjuvant (Sigma-Aldrich, F5506). The serum of the immunized mouse was obtained as a GRP7 antibody, and we tested it by WB detection using protein extracts from grp7-1 mutant and plants that were transformed with distinct GRP7 mutant forms tagged with GFP (fig. S6D). We found that the GRP7 antibody can strongly detect the GRP7 and GRP7-GFP protein, but the GRP7 antibody still detects a dim band in the grp7-1 mutant background. We assume that this band was caused by elevated levels of the highly similar homolog GRP8 in the grp7-1 mutant background, as reported previously (15). Because our GRP7 antibody detected only a dim band when GRP8 was strongly expressed in combination with a relatively high loading amount in WB, and FER can also interact with GRP8, we suggest that our GRP7 antibody was suitable to perform the RALF1-FER pathway–related biochemical assays in this project.

GST pull-down analyses

The construction and expression of His-FER-KD were described previously (18). GRP7 ou GRP8 was cloned into the pGEX4T-1 vector and transformed into E. coli BL21 star (DE3) cells that produced the GST fusion protein upon induction by 0.5 mM isopropyl-β--thiogalactopyranoside. The His-FER-KD and GRP7-GST/GRP71–86-GST/GRP787–176-GST/GST proteins were coincubated with 30 μl of glutathione agarose beads (Thermo Fisher Scientific, 16100) in binding buffer[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCland10mMMgCl[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCland10mMMgCl[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCland10mMMgCl[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCland10mMMgCl2]at 4°C for 6 hours. The beads were washed with washing buffer I [50 mM tris-HCl (pH 8.0), 300 mM NaCl, and 0.5% Triton X-100] for 10 min and then two times with washing buffer II[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCland10mMMgCl[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCland10mMMgCl[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCland10mMMgCl[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCland10mMMgCl2], each for 20 min. The proteins on the beads were eluted by boiling in SDS loading buffer, separated by 1× SDS–polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), and detected by immunoblotting using a GST (SC-80998, Santa Cruz Biotechnology) or His antibody (M20001, Abmart). The GST input protein was visualized by Coomassie brilliant blue (CBB) staining.

Co-IP analyses

One-week-old Col-0 and FER-FLAG transgenic seedlings were ground to powder with liquid nitrogen. The total proteins were extracted with NEB buffer [20 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 40 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), and protease inhibitor (Thermo Fisher Scientific, 78420)] and NEB-T buffer (NEB buffer containing 1% Triton X-100) for 1 hour at 4°C. After centrifugation at 14,000g for 20 min, the supernatant was incubated with 30 μl of anti-FLAG affinity gel (Sigma, A2220) at 4°C for 4 hours. The agarose beads were washed three times with washing buffer [20 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 40 mM KCl, and 0.1% Triton X-100]. The immunoprecipitates associated with the agarose gel were boiled in 1× SDS loading buffer for 10 min, separated by 12% SDS-PAGE, and detected with anti-FLAG (Abmart, M20008; 1:4000) and anti-GRP7 antibodies (1:3000). Notably, to analyze the total protein level of FER and compare the interaction impacts of the RALF peptide, we shortened the SDS-PAGE running time to prevent separation of the phosphorylated and dephosphorylated forms of FER (18, 20).

Phosphorylation assays and identification of phosphorylation sites

Recombinant His-FER-KD and its kinase-dead variant (His-FERK565R-KD) were generated as previously described (18). The in vitro phosphorylation assay was performed as described by Du et coll. (18). Briefly, 1 μg of His-FER-KD or His-FERK565R-KD and 1 μg of GRP7-GST or GRP7mut6A-GST were added to kinase assay solution[25mMtris-HCl(pH75)10mMMgCl[25mMtris-HCl(pH75)10mMMgCl[25mMtris-HCl(pH75)10mMMgCl[25mMtris-HCl(pH75)10mMMgCl2, 1 mM CaCl2, and 1 mM dithiothreitol (DTT)]. The assay was initiated by adding 1 mM adenosine triphosphate and incubated for 30 min at 30°C. For CIP assays, alkaline phosphatase (Thermo Fisher Scientific, EF0651) was added to the solution and incubated at 30°C for 10 min. The reaction was stopped by the addition of 4× SDS loading buffer and subsequent incubation at 95°C for 10 min. The proteins were then separated by 12% (w/v) SDS-PAGE and analyzed by WB using anti-pSer (1:3000; Abcam, ab9332) and anti-pTyr (1:3000; Abcam, ab17302) antibodies. For phosphorylation site identification, GRP7 was coexpressed with the FER-KD or FERK565R-KD via our coexpression system that can identify the substrate phosphorylation residue(s) of FER kinase (19) and then purified and subjected to alkylation/tryptic digestion followed by MS (19). The His-FERK565R-KD and GRP7 combination was used as a negative control.

For phosphorylation assays in vivo, 2 g of GRP7-GFP, GRP7-GFP/fer-4, or Col-0 seedlings were mock-treated or treated with 1 μM RALF for 30 min, and then, total protein was extracted by using 0.5 ml of NEB buffer [20 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 40 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% protease inhibitor mixture (Thermo Fisher Scientific, 78420), and 1% phosphatase inhibitors (Bimake, B15001)] and 0.5 ml of NEBT buffer [20 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 40 mM KCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 1% protease inhibitor mixture (Thermo Fisher Scientific, 78420), and 1% phosphatase inhibitors (Bimake, B15001)]. The homogenized sample was centrifuged twice at 12,000g for 10 min each at 4°C. Then, 20 μl of GFP-trap bead (Chromotek, gta-100) for each sample was used to immunoprecipitate GRP7-GFP protein complexes at 4°C for 5 hours. The beads were washed three times in washing buffer [20 mM Hepes-KOH (pH 7.5), 40 mM KCl, and 0.1% Triton X-100] at 4°C. Last, the beads were resuspended in 40 μl of 2× SDS loading buffer, boiled for 10 min, separated by 12% (w/v) SDS-PAGE, and probed with anti-pSer (1:3000; Abcam, ab9332), anti-pTyr (1:3000; Abcam, ab17302), and anti-GFP antibodies (1:5000; CMC, at0028). For phosphorylation site identification in vivo, 8 g of GRP7-GFP was mock-treated or treated with 1 μM RALF1 for 30 min and extracted with 1 ml of NEB and 1 NEBT buffer for 1 hour at 4°C. Eighty microliters of GFP-trap beads (Chromotek, gta-100) was used for each sample. After washing three times in washing buffer, the beads were added 120 μl of 2× SDS loading buffer and boiled for 10 min. Then, 12% (m/v) SDS/PAGE was used for protein separation. The GRP7-GFP bands were excised and cut into small pieces after CBB staining. Then, the pieces were dehydrated, and the proteins were reduced, alkylated, digested, and analyzed by MS as described previously (19, 46).

MS data analysis

For label-free quantification, raw files were processed using MaxQuant (47) (version 1.6.1.0) and Proteome Discoverer (Thermo Fisher Scientific, version 1.4). GRP7 phosphopeptides were identified by searching all tandem MS spectra against version of the Araport11_pep_201606 sequence database and filtering using a false discovery rate of <0.01 at the peptide level and of <0.05 at the protein level by MaxQuant. We selected carbamidomethylation of cysteines as the fixed modification and used oxidation (M) and phosphorylation (STY) as variable modifications. In addition, we used Proteome Discoverer to assess phosphorylation localization. After identification, we performed GRP7 protein label-free quantitation of phosphopeptides with the MaxLFQ algorithm integrated in the MaxQuant software suite according to Liu et coll. (46).

Phylogenetic tree construction

Protein sequences of different species of GRP7 were blasted and downloaded from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) on the basis of the protein sequence of AtGRP7. Sequences of GRP7-like protein from different species were aligned using DNAMAN and displayed with iTOL (48). To analyze the phosphorylation sites, we randomly selected 12 species in the same branch and aligned the sequences using DNAMAN and BioEdit (version 7.0.4) with default settings.

Flagellin22-induced ROS production

Leaves of 4-week-old plants were cut into 4 mm by 4 mm pieces. Leaf pieces were transferred to 96-well plates containing 100 μl of sterile water (pH 5.7) and allowed to recover in the dark for 16 hours. The next day, the water was replaced by 75 μl of 2 mM MES-KOH (pH 5.8) to mimic the apoplastic pH. Leaf pieces were incubated further for 5 hours before adding 20 μM luminol L-012 (Sigma-Aldrich), horseradish peroxidase (10 μg/ml; Sigma-Aldrich), 100 nM flg22, and 200 nM RALF1 peptide solution. Luminometric output was measured with a FLUOROSKAN ASCENT FL (Thermo Fisher).

Immunofluorescence assay

Immunofluorescence was performed as previously described (49). Briefly, 5-day-old Col-0 and fer-4 seedlings were mock-treated or treated with 1 μM RALF1 for 3 hours. Then, the seedlings were incubated in fixative solution [1× phosphate-buffered saline (PBS) (pH 7.2) containing 2% paraformaldehyde and 0.1% Triton X-100] for 5 min and subsequently vacuum-infiltrated for 10 min in a vacuum pump (0.05 Mpa) at room temperature (24°C). Then, we removed the fixative solution, washed the seedling three times for 10 min each with 1× PBS, and digested the cell wall with cell wall digestion solution [2% Driselase (Sigma, D8037) in 1× PBS] for 18 min at 37°C. We washed the seedling with 1× PBS five times and then incubated the seedling in tissue permeation solution (3% IGEPAL CA-630 and 10% dimethyl sulfoxide in 1× PBS) for 20 min. We washed the seedling three times with 1× PBS and then incubated it with blocking solution [3% BSA (Ameresco, 0332) in 1 × PBS] for 1 to 2 hours. Then, we incubated it with anti-GRP7 or serum control antibody for 10 hours at 4°C in the dark and washed it with 1× PBS three times before incubating it with goat anti-mouse secondary antibody (Sungene Biotech, GM200G-37C) in blocking solution at 37°C for 5 hours in the dark. Last, we washed the sample five times with 1× PBS, incubated the seedling with DAPI for 30 min, washed the sample three times with 1× PBS, stored it at 4°C, and prepared it for observation within 3 days.

Subcellular fractionation

Nuclear and cytoplasmic protein fractionation was performed as previously described (19, 22). Briefly, 1-week-old Col-0 and fer-4 seedlings were treated with 1 μM RALF1 for 3 hours and then ground in liquid nitrogen. Samples were extracted with 100 μl of fractionation buffer[20mMtris-HCl(pH70)250mMsucrose25%glycerol20mMKCl2mMEDTA25mMMgCl[20mMtris-HCl(pH70)250mMsucrose25%glycerol20mMKCl2mMEDTA25mMMgCl[20mMtris-HCl(pH70)250mMsucrose25%glycerol20mMKCl2mMEDTA25mMMgCl[20mMtris-HCl(pH70)250mMsucrose25%glycerol20mMKCl2mMEDTA25mMMgCl2, 30 mM beta-mercaptoethanol, 1× protease inhibitor cocktail, and 0.7% Triton X-100]and then centrifuged at 5000g for 5 min. The supernatant was considered the cytoplasmic fraction and was stored on ice until use. The pellet was further washed with resuspension buffer[20mMTris-HCl(pH70)25%glycerol25mMMgCl[20mMTris-HCl(pH70)25%glycerol25mMMgCl[20mMTris-HCl(pH70)25%glycerol25mMMgCl[20mMTris-HCl(pH70)25%glycerol25mMMgCl2, and 30 mM beta-mercaptoethanol]three times to obtain the nuclear fraction. We used glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [(GAPC) (1:1000; AS152894, Agrisera)] and histone H3 antibodies (1:5000; ab1791, Abcam) to confirm the fractionation of the nucleus and cytoplasm by WB, respectively.

GRP7 binding site analysis

We downloaded the genomic sequences of 2225 genes that had splicing defects in the grp7-1 8i mutant from TAIR (www.arabidopsis.org/tools/bulk/sequences/index.jsp). FIMO (within the MEME suite) (50) was used to find the UU/GCUGG motif in the genomic sequences. We chose P < 0.001 as the filter and scanned the given strand only.

RNA-EMSA assays

Fluorescein isothiocyanate (FITC)–labeled RNA probes were generated by TsingKe Biological Technology Co. Ltd. Probes were also amplified with the primers indicated by the arrowheads in fig. S10B. The RNA-protein binding reaction was performed by incubating 0.2 pM FITC-labeled probe with 30 to 50 pM purified GRP7-GST and GST protein. To perform the competition experiments, 50 pM purified GRP7-GST and GST protein and 100× unlabeled competitor A or 100× nonspecific competitor B were incubated in binding buffer for 15 min, followed by the addition of 0.2 pM FITC-labeled probe for 20 min. To avoid RNA degradation, we added 1 μl of ribonuclease (RNase) inhibitor (Thermo Fisher, N8080119) to each reaction. Next, the binding reaction mixture was loaded onto a native 4% polyacrylamide and 0.5× tris-borate EDTA gel, which was run for 40 min and then exposed to a fluorescence imager plate. Phosphorylated GRP7 and unphosphorylated GRP7 were generated using the ABA-induced FER substrate phosphorylation system as previously described (19).

RIP and qPCR analyses

Three grams of 7-day-old 35S::GFP, GRP7-GFP, et GRP7-GFP/fer-4 seedlings were harvested at ZT 12 and mock-treated or treated with 1 μM RALF1 peptide (in ½ MS liquid medium) for 2 hours and then placed under vacuum for 15 min (0.1 Mpa). The working concentration of 0.125 M glycine was added to quench cross-linking, and the seedlings were subjected to an additional 6 min of vacuum treatment. The plants were rinsed twice with water, then ground to powder with liquid nitrogen, and solubilized with 300 μl of extraction buffer[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCl4mMMgCl[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCl4mMMgCl[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCl4mMMgCl[50mMtris-HCl(pH80)150mMNaCl4mMMgCl2, 0.1% Igepal, 5 mM DTT, 0.1% SDS, 10 mM ribonucleoside vanadyl complex (NEB, S1402S), RNase inhibitor (80 U/ml; Thermo Fisher, N8080119), 1 mM PMSF, and protease inhibitor tablets]. After incubating for 1 hour at 4°C, the extracted samples were centrifuged at 12,000g for 15 min, and the supernatant was transferred to a fresh tube. One hundred microliters of supernatant was used as input and stored at −80°C, and 100 μl of supernatant was added to 20 μl of GFP-trap beads that had been prewashed three times in binding/washing buffer [50 mM tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, and 0.1% SDS]. Then, the beads were incubated at 4°C overnight, washed with washing buffer three times, and centrifuged at 1000g for 2 min. The beads were incubated for 10 min at 55°C in RIP elution buffer [100 mM tris-HCl (pH 8.0), 100 mM EDTA, 1% SDS, and RNase inhibitor (80 U/m)]. The protein was degraded by proteinase K, and RNAs were isolated by adding 1 ml TRIzol of RNA extraction reagent (Takara). The RNA pellet was washed with 70% (v/v) ethanol, air-dried, and dissolved in RNase-free water. The RNA sample was incubated with DNase I and reverse-transcribed using a cDNA synthesis kit (Fermentas, K1622) for qPCR. In parallel, input samples were used for quantification.

Statistics

Any significant differences in data were analyzed by two-tailed Student’s t test or by multivariate comparison (one-way ANOVA) using SPSS (version 17.0) software. All statistical tests are clearly described in the figure legends and/or in the Materials and Methods. Correlations between splicing changes were represented with the Spearman correlation coefficient r; |r| ≥ 0.7 indicates strong correlation. Bar graphs were generated by GraphPad Prism 6 and show the means ± SD. Density dot plots and heat maps were drawn using R software.

Remerciements: We thank J. Alfano, Y. Zhang, P. Duque, and J. Kufel for providing the seeds. We thank H. Xue and D. Caddell for editing the manuscript. Le financement: This work was supported by grants from the National Natural Science Foundation of China (NSFC-31871396, 31571444, and 31400232), Young Elite Scientist Sponsorship Program by CAST (YESS20160001), and China Postdoctoral Science Foundation funded project (2019 M662763). Contributions d’auteur: F.Y. conceived the project and designed research. L.W., S.Z., C.L., Y.M., J.T., H.L., X.L., and J.X. performed research. D.S., Q.L., and T.Y. contributed new reagents/analytic tools. B.W. and Z.H. performed bioinformatics analyses. L.W. and F.Y. analyzed data. LW., F.Y., and D.S. wrote the manuscript. All authors reviewed and approved the manuscript for publication. Intérêts concurrents: The authors declare that they have no competing interests. Disponibilité des données et des matériaux: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. The sequencing data reported in this paper are summarized in table S1 and are deposited in the NCBI SRA database (SRR8362598).



Source link